Hình ảnh protein và tự động hóa thẩm tách miễn dịch

Việc phân tích hình ảnh và sinh hóa về sự biểu hiện và biến đổi của protein từ lâu đã bị hạn chế do tính chất hay thay đổi của kỹ thuật xét nghiệm Western blot, mỗi lần một protein. Thận trọng về hình ảnh protein, kỹ thuật tái tạo và định lượng đáng tin cậy để tối ưu hóa thông qua tự động hóa, đưa phân tích protein phù hợp với di truyền học.

Sinh học thường trở nên ấn tượng với thuật ngữ của nó, như trường hợp đặt tên các kỹ thuật để hiểu rõ hướng dẫn và nghiên cứu di truyền và sinh hóa truyền các chức năng cụ thể cho tế bào. Southern blot được đặt tên cho Edward Southern, người trong những năm 1970 đã phát minh ra quy trình chuyển các phân tử ADN từ gel agarose lên màng tổng hợp để thăm dò chúng bằng các trình tự bổ sung và xác định sự hiện diện của vùng quan tâm.

Khi các nhà điều tra Stanford đưa ra một phương pháp tương tự để chuyển RNA thông tin, tất nhiên nó được gọi là phương pháp Northern blot. Western blot là sự chuyển tương đương của hàm lượng protein từ dịch lọc tế bào được phân giải bằng gel sang màng tổng hợp có thể được thăm dò về mức độ biểu hiện và các sửa đổi sau dịch mã. Trong phép ẩn dụ của luận thuyết trung tâm, chỉ có ba hướng cơ bản, do đó không có Eastern blot nào ngoại trừ như một phần mở rộng của các nguyên tắc Western blot. Chưa bao giờ tìm thấy các nhà khoa học có tên Northern, Western và Eastern.

Western blot là một quá trình phức tạp và tốn nhiều công sức với vô số các bước riêng lẻ dễ xảy ra sai sót và không nhất quán. Điều này là vấn đề của nhiều nghiên cứu quan trọng phụ thuộc vào khả năng các điều kiện sao chép trong đó sự biểu hiện hoặc sửa đổi của các protein cụ thể tăng hoặc giảm để đáp ứng với các nhiễu loạn trong điều kiện nuôi cấy tế bào. Do đó, việc tự động hóa thành công sẽ giúp ích rất nhiều cho các phòng thử nghiệm trong xét nghiệm sinh hóa và protein của họ.

Trong phương pháp Western blot, một nhà điều tra thu hoạch và phá vỡ các tế bào hoặc mô; phân tách protein theo kích thước qua SDS-PAGE (điện di trên gel natri dodecyl sulfat-polyacrylamide); chuyển nồng độ của gel bằng cách cho dòng điện chạy qua nó lên một màng tích điện; thăm dò màng qua đệm với các kháng thể liên kết với protein quan tâm, tiếp theo vào ngày hôm sau do một kháng thể thứ cấp liên kết với protein thứ nhất và được liên hợp với một enzym, peroxidase cải ngựa, khi một chất phát quang hóa học, xúc tác được hoạt hóa phát ra các photon ánh sáng. Sau toàn bộ quá trình này, kết quả khó đoán hoặc không rõ ràng, bước khắc phục sự cố hợp lý nhất thường là bắt đầu lại từ đầu.

Phim tia X có thể phát hiện được ánh sáng phát ra, có độ nhạy cần thiết để bảo tồn các photon phát ra như một dạng dải đặc trưng cho trọng lượng phân tử của protein. Những hạn chế của màng phân giải protein trong các mẫu khác nhau trên cùng một dấu vết  với các mức độ biểu hiện cao khác nhau và sự cần thiết chiếm dụng không gian để duy trì phòng tối, trong khoảng hai thập kỷ qua đã thúc đẩy việc tối ưu hóa của các máy ảnh để bàn thu được các chỉ số biểu hiện protein bằng cách sử dụng các thiết bị kết hợp sạc để tạo ra kết quả ảo trong thang độ xám.

Những hình ảnh này cho thấy một bước quan trọng đối với tự động hóa — khi các biến có khoảng thời gian phơi sáng rời khỏi tay người dùng, các hệ thống hình ảnh có thể tự động điều chỉnh và lấy nét để có được hình ảnh tốt nhất và các gói phần mềm liên quan cho phép định lượng mức độ biểu hiện protein mà không cần cho các thiết bị phụ kiện như máy quét bên ngoài hoặc máy đo mật độ. Hơn nữa, việc duy trì một dải động tuyến tính lên đến bốn bậc độ lớn cho phép người dùng thu được kết quả đáng kể trong các đốm màu đơn lẻ mà mức độ biểu hiện của protein rất khác nhau. Máy ảnh để bàn từ các nhà cung cấp như LI-COR, Analytik Jena và Invitrogen trở thành tiêu chuẩn trong nhiều phòng thử nghiệm với khối lượng lớn quy trình làm việc theo phương pháp Western blot .

Tuy nhiên, trong những phòng thử nghiệm tương tự, tự động hóa thực sự không những có thể tiết kiệm đáng kể thời gian và nguồn dành cho phương pháp Western blot và tạo hình ảnh, mà còn có thể loại bỏ sự lặp lại quá mức và khó chịu bắt nguồn từ việc dễ xảy ra lỗi và bản chất thay đổi của chính kỹ thuật .

Thiết bị ProteinSimple đưa ra một loạt các công cụ hợp lý hóa và tự động hóa toàn bộ quá trình Western blot, từ việc nạp các chất ly giải chứa protein đến hình ảnh và phân tích mức độ biểu hiện. Công nghệ này sử dụng một hệ thống dựa trên mao quản để phá vỡ các bước tải, chạy và chuyển gel, giảm phần lớn thời gian và loại bỏ các nguồn lỗi chính trong giao thức, đồng thời tăng độ nhạy và thông lượng. Các ống mao dẫn với chất nền xếp chồng và phân tách có chức năng tương tự như ProteinSimple hút SDSPAGE, hệ thống áp dụng điện áp để tách chúng một cách hiệu quả và ánh sáng tia cực tím cố định protein dựa vào thành mao quản, thay thế cả gel và màng trong xét nghiệm chuẩn. Sau đó, các mao mạch hút các kháng thể, chất nền phát quang và hệ thống tạo ra một loạt hình ảnh thông qua chụp CCD.

Gói phần mềm Compass từ ProteinSimple thiết lập bản phân tích đầy đủ về quá trình chạy thử nghiệm và có thể tạo ra hình ảnh Western blot thang độ xám, hình ảnh nhuộm protein màu và các phân tích định lượng về trọng lượng phân tử, cường độ và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu. Ngoài ra, các thiết bị ProteinSimple có thể tạo ra các hình điện đồ với giá trị chính xác cao nhất và xác định các điểm đẳng điện để sửa đổi protein, thông qua phân tách dựa trên điện tích. Hệ thống dựa trên mao quản sử dụng lượng thuốc thử rất nhỏ so với các kỹ thuật Western blot và máy ảnh có thể phát hiện các protein có kích thước từ 2 đến 440 kilodalton. Các thiết bị ProteinSimple có nhiều kích cỡ khác nhau và được tối ưu hóa cho các chiến lược nghiên cứu khác nhau.

Để cải thiện trực tiếp khả năng tái tạo và quản lý thời gian với các thí nghiệm quy mô nhỏ hơn, các mô hình Wes và Jess chạy các mảng mao quản lên đến 25 mẫu trong ba giờ, so với khoảng 24 giờ với thực hành phương pháp Western blot. Peggy Sue lớn hơn chạy định dạng 96 giếng, có thể thu được hình ảnh và thống kê số liệu từ các mẫu lấy từ ít nhất là 25 tế bào và do đó có thể kết hợp được với quy trình sàng lọc thông lượng cao, xác thực sàng lọc giải trình tự RNA ở cấp độ protein hoặc thực hiện sàng lọc protein trong phát hiện ma tuý.

ProteinSimple cũng đã mở rộng các nguyên tắc tạo ảnh protein tự động vượt ra ngoài phương pháp Western blot cổ điển. Thiết bị Milo của họ có thể thử nghiệm, hình ảnh và định lượng protein trong các tế bào đơn lẻ, sử dụng đồng thời lên tới 12 kháng thể để cung cấp ảnh chụp nhanh về tính không đồng nhất trong quần thể tế bào. Xét về dấu ấn, chi phí và thông lượng, vì vậy nó có tiềm năng cạnh tranh thành công với các phương pháp đo tế bào dòng để thử nghiệm các mẫu biểu hiện của protein.

Hơn nữa, xác nhận danh mục các kháng thể đối với phương pháp Western blot lớn hơn tới 100 lần so với dòng chảy và sự phá vỡ hóa học cho thấy nhiều proteome hơn so với các phương pháp thăm dò hoặc cố định bề mặt tế bào được sử dụng trong nghiên cứu dòng chảy. Với tự động hóa hình ảnh và giao thức, bắt đầu nhận ra vị trí quan trọng của kỹ thuật phân tích sinh hóa trong các hoạt động quy mô lớn, thông lượng cao.

Tiến sĩ Brandoch Cook

Tố Quyên dịch

Nguồn: Lab Manager- Hoa Kỳ