Phương pháp đo tế bào dòng chảy để sàng lọc thuốc

Phương pháp đo tế bào dòng chảy đã phát triển từ mục tiêu ban đầu là kỹ thuật đếm tế bào để xác định đặc điểm kiểu hình tế bào mạnh mẽ và thiết yếu. Sự bổ sung gần đây của hệ thống phân tích tế bào theo dòng chảy và các nguyên tắc của các thiết bị công nghệ nano và kênh dẫn vi lưu (microfluidic), đã cho phép các nhà nghiên cứu mở rộng khả năng của phép đo tế bào để sàng lọc thông lượng cao, đồng thời thu thập và nghiên cứu các ngăn dưới tế bào và các loại tế bào hiếm.

Chủ yếu của phép đo tế bào dòng chảy nằm ở nguyên tắc dòng điện tác dụng lên các hạt di chuyển qua một khẩu độ dẫn đến trở kháng tỷ lệ với thể tích của chúng.

Wallace Coulter đã được cấp bằng sáng chế cho phát minh này và áp dụng nó vào máy đếm tế bào cùng tên của mình. Vào thập kỷ 70, các phòng thử nghiệm của Los Alamos đã mở rộng dựa trên Nguyên tắc máy đếm tế bào và tạo ra các thiết bị trong đó ánh sáng laser phân tán do có thể sử dụng các tế bào đi qua điểm “thẩm vấn” để suy ra các thông số như kích thước, tính toàn vẹn của màng và sự tăng sinh.

Thử nghiệm tạo ra các kháng thể đặc hiệu cho các protein bề mặt tế bào, sự ra đời gần đây hơn của các hệ thống báo cáo di truyền, đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc mô tả đặc tính của các loại tế bào khác nhau thông qua việc kích thích các hợp chất fluorop liên hợp hoặc các protein dung hợp huỳnh quang tự nhiên bằng các bước sóng laser tương ứng.

Thông qua những đổi mới này, có thể xác định, định lượng, đôi khi thu thập và cấy truyền các loại tế bào quan trọng từ các quần thể không đồng nhất. Đó là những khả năng mà các kỹ thuật phân tử và sinh hóa như qPCR và phương pháp western blotting (là một kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử và di truyền miễn dịch để phát hiện các protein cụ thể trong một mẫu đồng nhất hoặc chiết xuất mô) là không đủ, vì chúng chủ yếu giải quyết các mẫu dưới dạng tĩnh mà không có sự biến đổi bên trong.

Với chủ yếu dòng chảy ngày càng mạnh mẽ, các nhà điều tra có thể đạt được các mục tiêu như nâng cao hiệu quả và khả năng tồn tại trong các chiến lược dựa trên tế bào gốc để tìm ra các loại tế bào có liên quan đến điều trị.

Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy thông thường

Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy thông thường sử dụng tập trung thủy động lực học để sắp xếp các tế bào thành các sắp xếp đơn lẻ để chúng vượt qua điểm “thẩm vấn” dưới dạng các tế bào riêng lẻ. Dung dịch bảo vệ trong một ống dài đóng vai trò là ống dẫn mà dụng cụ bơm vào và tập trung mẫu để tạo dòng lõi (một dòng rất hẹp chỉ để từng tế bào hoặc từng hạt đi qua). Trong dung dịch bảo vệ, các lực thủy động lực vượt qua sự kiểm soát của bộ phận điều tra và các hạt nhanh chóng tăng tốc, do đó tuân thủ các giới hạn về phân bố Poisson đặt ra giới hạn hạn chế đối với các tế bào được phát hiện cũng như ghi lại khối lượng bơm mẫu vào dòng này.  

Các giới hạn phát hiện chính xác của kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy thông thường khác nhau, nhưng dao động trong khoảng 25.000 tế bào mỗi giây, với đường kính từ một đến 20 micrômét, thường có thể tích từ một mililit trở xuống, nhằm mục đích tối ưu hóa thời gian và hiệu quả xét nghiệm. Khi vượt quá, thiết bị đo đạc có thể bị tắc nghẽn hoặc ghi lại quá nhiều tế bào kép để dữ liệu không đủ thông tin hoặc chỉ đơn giản là hoạt động không đủ để đăng ký số lượng tế bào mong muốn trong phân bổ thời gian trước khi người dùng tiếp theo mất kiên nhẫn.

Những giới hạn này không phù hợp với các nhu cầu hiện đại của sinh học tế bào, vốn đặt ra giá trị cao đối với thông lượng và việc xác định các loại tế bào hiếm, tế bào di truyền hoặc mới lạ. Việc tuân thủ các mục tiêu này thường đòi hỏi sự tập trung của môi trường thông qua các bước ly tâm mất nhiều thời gian.

Hơn nữa, yêu cầu khối lượng nhỏ vì lợi ích của thời gian vận hành máy dẫn đến tỷ lệ % cao bị mất trong lượng không gian, hàm lượng của chúng bị lãng phí trước khi tiêm và khi trục xuất sau khi vận hành, thở phào nhẹ nhõm trong phân tích cuối cùng.

Hệ thống phân tích tế bào theo dòng chảy và tăng thông lượng

Việc bổ sung gần đây của hệ thống phân tích tế bào theo dòng chảy vào kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy thông thường giúp cải thiện thông lượng và tối ưu hóa việc xác định và thu thập các tế bào hiếm gặp. Đang phát triển hệ thống phân tích tế bào theo dòng chảy có thể phân tích một loạt các hạt kích thước rộng hơn, chính xác hơn và trong các kênh rộng hơn so với các thiết bị thông thường.

Do đó, nó sử dụng thời gian vận chuyển dài hơn với vận tốc tuyến tính giảm, cho phép tốc độ phân tích cao hơn, với khối lượng mẫu lên đến cấp độ lớn hơn so với quá trình tập trung thủy động lực học. Tương đối tăng thể tích mẫu sẽ giảm thiểu lượng không gian và loại bỏ các bước cô đặc cần thiết. Kết quả thực tế là hiệu quả và thông lượng cao hơn, xác nhận nó là một công nghệ mạnh mẽ để sàng lọc hóa chất và kháng thể.

Phát hiện này cực kỳ quan trọng, xem xét vấn để về chi phí, đào tạo và phối hợp liên quan đến việc sử dụng các cơ sở cốt lõi sàng lọc, so với việc duy trì một máy để bàn trong một không gian phòng thử nghiệm riêng lẻ. Người ta cũng có thể thu được các quần thể đáng kể của khối u hoặc tế bào nội mô tuần hoàn hiếm gặp từ dung dịch bảo vệ mà không cần các bước cô đặc có thể mất thời gian và có hại cho chính tế bào trước khi phân tích.

Định nghĩa tế bào hiếm là tế bào chiếm ít hơn 0,01 % tổng số tế bào, do đó, để có được 1.000 tế bào hiếm, yêu cầu chuẩn bị mẫu chứa tổng số ít nhất 10 triệu tế bào. Máy đo tế bào theo dòng chảy có thể xử lý hiệu quả các khối lượng tương ứng, đặc biệt là trong nhiều điều kiện thử nghiệm, trong khi các thiết bị thông thường không làm được.

Các phòng thử nghiệm riêng lẻ đã bắt đầu mở rộng khả năng phân tích tế bào thông qua các dòng chảy song song và với các kênh vi lỏng. Việc sử dụng sóng âm qua nhiều luồng song song có thể tăng tốc độ dòng chảy lên hơn 50 lần và tốc độ phân tích lên hơn 100.000 tế bào mỗi giây.

Ngoài ra, áp dụng sóng âm truyền đi cho các kênh vi lỏng có thể đồng thời cải thiện hiệu quả và giảm  trọng khối bằng cách loại bỏ hoàn toàn dung dịch bảo vệ.

Có những lợi ích và bất lợi đối với phương pháp này, bởi vì trong khi dung dịch bảo vệ kéo dài theo chiều rộng của một thiết bị thông thường và về bản chất làm loãng dòng mẫu, nó cũng giữ cho các tế  bào không tiếp xúc và làm ô nhiễm thành kênh.

Việc kết hợp các sóng di chuyển với hình dạng kênh vi lỏng cong lặp lại có thể cho phép phân tích hiệu quả dựa trên các lực dòng vật lý nội tại, tối ưu hóa hiệu quả phân tích, độ tinh khiết và khả năng tồn tại của các tế bào được thu thập.

Dòng chảy kích thước nano và các túi ngoại bào

Cuối cùng, đã xác định đặc điểm của các thành phần dưới tế bào và sử dụng chúng làm dấu ấn sinh học, trước đây không khả thi vì phép đo tế bào thông thường có giới hạn phát hiện thấp hơn và không đầy đủ.

Sự phát triển này phá vỡ quá trình phân tích các bào quan và túi ngoại bào (EVs) khỏi các bước cố định và chuẩn bị lạnh, cũng như phân tích bằng kính hiển vi điện tử tốn kém. Các thiết bị có nhiều tia laser bước sóng ngắn công suất cao và ứng dụng các nguyên tắc công nghệ nano để phát hiện, có thể phân biệt chính xác sự khác biệt về kích thước trong các hạt đã hiệu chuẩn xuống đến 100 nanomet và phát hiện liposome bằng một nửa đường kính đó.

Do đó, đã sử dụng NanoFlow trong các nghiên cứu mô hình bệnh tật để phân biệt liệu các tế bào tốt hơn là giải phóng các exosomes biểu hiện các protein bề mặt đặc trưng, ​​hay các vi hạt nảy chồi từ màng tế bào tương đối mịn hơn và lớn hơn. Với những nghiên cứu này và các nghiên cứu mới nổi khác, các nhà điều tra có thể tiến tới phân tích thông lượng cao và phân chia giai đoạn của các tế bào ung thư khác nhau, có các đặc tính nội tại quyết định tỷ lệ EV mà chúng giải phóng.

Sức mạnh của phương pháp đo tế bào dòng chảy để mô tả đặc điểm của các ngăn dưới tế bào và để xử lý khối lượng lớn với thông lượng cao, phát triển rõ ràng tiềm năng của nó như một công cụ chẩn đoán.

Tiến sĩ Brandoch Cook

Bình Minh dịch

Nguồn: Lab Manager- Hoa Kỳ