Đẩy nghiên cứu virus đến giới hạn: Những kiến thức từ kính hiển vi định vị đơn phân tử

Virus SARS-CoV-2 đã mang đến cho các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới một thách thức lớn. Kể từ khi dịch bệnh bùng phát, cộng đồng khoa học đã kết hợp với nhau để đẩy nhanh sự phát triển trong chẩn đoán và điều trị hiệu quả cho COVID-19. Tuy nhiên, nghiên cứu virus là một thách thức vô cùng lớn do khó khăn trong việc mô tả các hạt có đường kính dưới 250nm. May mắn thay, hình ảnh đơn phân tử và siêu phân giải có thể cung cấp những thông tin có giá trị. Ví dụ, cấu trúc virus, cơ chế lây nhiễm và liên kết với thụ thể, từ đó tạo thuận lợi cho việc xác định các mục tiêu tiềm năng cho thuốc chống siêu vi.

Kích thước virus nằm trong khoảng từ 20-250nm, xuất hiện dưới dạng các đốm mờ khi được chụp trên kính hiển vi ánh sáng thông thường bị giới hạn nhiễu xạ. Cho đến gần đây, kính hiển vi điện tử là kỹ thuật được lựa chọn để nghiên cứu virus, nhưng việc chuẩn bị mẫu phức tạp, chi phí cao và khó khăn trong việc xác định vị trí của một phân tử sinh học cụ thể hạn chế rất nhiều tính hữu ích của nó đối với đặc tính của virus. Mặc dù kính hiển vi huỳnh quang tiêu chuẩn cho phép nhận dạng trực quan hóa các protein và phân tử sinh học cụ thể bằng cách sử dụng kết hợp kháng thể và fluorophores, nhưng độ phân giải thấp nên đã làm ngăn cản sự chi tiết về chính virus và tương tác tế bào virus.

Kính hiển vi định vị đơn phân tử (SMLM) là một kỹ thuật hình ảnh siêu phân giải, vượt qua giới hạn nhiễu xạ của ánh sáng, cho phép chụp ảnh có độ phân giải xuống tới 20nm. Mức độ chi tiết này cho phép các nhà nghiên cứu tiến hành các cuộc điều tra chuyên sâu về cách thức virus tập hợp, cách sắp xếp các thành phần khác nhau và cách thức virus tương tác với các tế bào. Ví dụ, chúng ta có thể hiểu rõ hơn về động học liên kết với thụ thể và virus.

Đạt được độ phân giải 20nm bằng SMLM

Trong kính hiển vi huỳnh quang, ánh sáng phát ra từ fluorophore xuất hiện dưới dạng một đốm mờ (đường kính ~ 200nm) do sự nhiễu xạ ánh sáng qua kính hiển vi, gọi là rào cản nhiễu xạ. Khi nhiều fluorophores được chụp cùng một lúc, những đốm mờ này chồng lên nhau khiến cho không thể phân biệt được giữa các fluorophore với nhau.

Ý tưởng trong SMLM là kích thích một phần nhỏ fluorophores trong mẫu tại một thời điểm nhất định để loại bỏ các tín hiệu chồng chéo khiến hình ảnh bị mờ. Điều này đạt được bằng cách làm cho fluorophores nhấp nháy để phát xạ từ mỗi fluorophore và tạm thời tách ra. Quá trình này được lặp lại liên tục nhiều lần cho đến khi hầu hết các fluorophores trong mẫu được chụp. Sau quá trình chụp như vậy, hình ảnh phân tử được xây dựng lại rõ nét. 

Một trong những kỹ thuật SMLM được sử dụng phổ biến nhất là Kính hiển vi quang học dựng ảnh ngẫu nhiên (dSTORM). dSTORM tận dụng các tính chất có thể quang hợp của thuốc nhuộm hữu cơ để đạt được sự kích hoạt ngẫu nhiên của fluorophores (Hình 1a). Fluorophores được tạo ra để nhấp nháy bằng cách điều khiển trạng thái điện tử của chúng, chuyển chúng thành BẬT (sáng) hoặc TẮT (tối). Fluorophores có thể được TẮT bằng cách sử dụng công suất laser cao và bộ đệm khử oxy. Các fluorophores sau đó có thể được BẬT lại bằng cách chiếu xạ bằng tia UV kích hoạt hoặc bằng phản ứng với oxy.

Hình 1

Kỹ thuật phân tử đơn cho nghiên cứu virus

dSTORM là một kỹ thuật lý tưởng để nghiên cứu virus vì nó kết hợp độ phân giải cao với khả năng hình dung các phân tử sinh học quan trọng. Hạt HIV (Hình 1b) đã được dán nhãn bằng kháng thể để trực quan hóa glycoprotein bề mặt và các yếu tố vật chủ tế bào được tích hợp vào hạt (cyan, AF488). Hình ảnh dSTORM xuất hiện giống như bất kỳ hình ảnh huỳnh quang nào khác ngoại trừ bây giờ với cấu trúc nano của mẫu được tiết lộ.

Bên cạnh việc chẩn đoán cấu trúc của virus, dSTORM có thể được áp dụng để thấy được cách virus xâm nhập vào tế bào và vào bộ máy tế bào mà nó chiếm quyền sao chép (Hình 2). Ví dụ, khi virus Ebola lây nhiễm vào tế bào, nó sẽ tổ chức lại hoàn toàn mạng tế bào Actin. Sau đó, virus định hình lại và sử dụng Actin để tạo mầm cho các cơ quan, cho phép virus nhân lên một cách hiệu quả. Hơn nữa, sự vận chuyển của virus được cấu thành sẽ do Actin đảm nhận. Trong một điểm giới hạn nhiễu xạ duy nhất, dSTORM có thể phân giải và phân biệt giữa sự kết hợp và vận chuyển của virus Ebola.

Hình 2

dSTORM là một phương pháp mạnh mẽ để truy cập thông tin cấu trúc và tương tác ở độ phóng đại. Tuy nhiên, hình ảnh thu được là một ảnh chụp nhanh và không cung cấp cái nhìn sâu sắc về bản chất động của chu kỳ virus. 

Để giải quyết vấn đề này, một kỹ thuật khác, theo dõi hạt đơn (SPT) có thể được sử dụng để trực quan hóa và định lượng sự di chuyển của protein virus (Hình 3). Tính di động của một phân tử được biểu thị bằng hệ số khuếch tán của nó, cho chúng ta cái nhìn rõ ràng về môi trường ngay tại thời điểm đó của phân tử và do đó có thể cho biết liệu phân tử có đang trải qua giới hạn/hạn chế ngẫu nhiên hoặc vận chuyển theo hướng. 

Việc giảm tốc độ khuếch tán có thể nói lên sự ràng buộc hoặc tương tác của phân tử được theo dõi với một phân tử hoặc cấu trúc khác. Hơn nữa, SPT có thể được mở rộng thành hình ảnh 2 màu để theo dõi đồng thời hai loại phân tử và xác định tương tác hoặc định vị không gian ưu tiên của chúng.

Hình 3

Hình ảnh virus trong tủ an toàn sinh học

Một mối quan tâm lớn với nghiên cứu virus là sự an toàn của nhà nghiên cứu. Nghiên cứu virus sống chỉ có thể được thực hiện trong các điều kiện an toàn nghiêm ngặt, buộc các nhà khoa học phải dùng đến nghiên cứu virus khi suy yếu hoặc các hạt giống virus (VLP) thay vì virus nguyên vẹn. 

Thường thì không rõ liệu các kết luận rút ra từ các thí nghiệm VLP có thể được áp dụng cho các virus thực sự hay không. Do đó, cần phải thực hiện các bước xác nhận thêm. May mắn thay, có một kính hiển vi siêu phân giải nhỏ có thiết kế nhỏ gọn, độc đáo giúp nó trở thành một công cụ lý tưởng để hỗ trợ nghiên cứu được thực hiện trong các phòng thí nghiệm giới hạn không gian, bao gồm tủ an toàn BSL3 và các cơ sở BSL4 mà không cần cơ sở hạ tầng bổ sung như như bảng quang học hoặc phòng tối, (Hình 3b). Điều này sẽ cho phép các nhà nghiên cứu nghiên cứu các virus không bị xáo trộn, kiểm tra trực tiếp hiệu quả của thuốc kháng virus.

Tóm lại, nghiên cứu về virus đòi hỏi sự hiểu biết chi tiết về sự đa dạng cấu trúc của chúng và các cơ chế mà chúng có khả năng lây nhiễm. Do đó, kỹ thuật phân tử đơn rất cần thiết cho sự phát triển của các công cụ chẩn đoán, vắc-xin và phương pháp điều trị chống virus.

Hoàng Nam dịch

Theo LabCompare