Những ranh giới mới trong kỹ thuật PCR: Tiến tới kỹ thuật số hoặc không?

Câu hỏi: Ông có sử dụng PCR cho ngành khoa học thú y hay không?

Hodzic: Cơ sở phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực (real-time PCR) của chúng tôi tại UC Davis là một trong những cơ sở PCR cốt lõi lâu đời nhất, đã tồn tại  được gần 15 năm. Cơ sở này có hai bộ phận, một cho việc nghiên cứu và một cho việc chẩn đoán.

Bộ phận nghiên cứu bao gồm các dịch vụ như tư vấn, hỗ trợ thiết kế thí nghiệm, thực hiện phân tích PCR và phân tích dữ liệu, phục vụ cho mọi người, cả trong lẫn ngoài trường. Tiếp theo, chúng tôi có một bộ phận chẩn đoán thú y, nơi chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh ở động vật nhỏ và lớn. Ở đó, chúng tôi nhận các mẫu từ các bác sĩ trong trường, cũng như từ ngoài tiểu bang và ở nước ngoài.

Chúng tôi đã chỉ định gần 100 xét nghiệm PCR để chẩn đoán phân tử cho nhiều mầm bệnh bao gồm vi khuẩn, virus, nấm và ký sinh trùng lây nhiễm ở các động vật lớn và nhỏ. Chúng tôi có các bảng hiển thị hệ thống hô hấp, thần kinh và tiêu hóa để phát hiện các mầm bệnh trong chăn nuôi ngựa, mèo và chó, thuận tiện hơn so với làm xét nghiệm các mầm bệnh đơn.

Câu hỏi: Khía cạnh thách thức nhất của PCR mà ông đã thực hiện là gì?

Hodzic: Khía cạnh thách thức nhất là thiết kế các thử nghiệm cụ thể cho một tác nhân gây bệnh cụ thể. Các tác nhân gây bệnh như virus đã trải qua nhiều đột biến nên việc tìm kiếm tất cả các chủng khác nhau của các loài trong một thí nghiệm là rất khó.

Đồng thời, tất cả các thử nghiệm của chúng tôi đều có hiệu quả cao, thường từ 95 đến 100 phần trăm. Việc tìm kiếm các thao tác thích hợp cho một xét nghiệm có thể là một thử thách, và sau đó là việc diễn giải dữ liệu. PCR là một kỹ thuật rất nhạy cảm, nhưng đôi khi, các kết quả cần phải được xác nhận bằng việc sử dụng một số kỹ thuật khác.

Câu hỏi: Làm thế nào để ông giải quyết vấn đề xung quanh sự ô nhiễm và độ tin cậy của dữ liệu?

Hodzic: Chúng tôi có những tiêu chuẩn rất cao về kiểm soát chất lượng và đảm bảo chất lượng. Mọi bước đi, từ việc nhận mẫu để xử lý, tách chiết oligonucleotide để thực hiện PCR và cuối cùng là phân tích dữ liệu, tất cả đều được kiểm soát tốt. Điều này đòi hỏi thời gian cùng với nỗ lực, và chắc chắn là không rẻ chút nào.

Chúng tôi thiết lập mọi thứ sao cho không có chỗ cho ô nhiễm. Một phần của phòng thí nghiệm được thiết lập để nhận mẫu, trong khi việc khai thác mẫu và PCR lại được thực hiện trong một phòng thí nghiệm khác. Tất cả các thuốc thử, sơn lót, thăm dò, và hỗn hợp của chúng tôi đều được lưu trữ trong một căn phòng sạch sẽ, và những người di chuyển giữa các phòng thí nghiệm phải tuân theo các quy trình để đảm bảo không có ô nhiễm.

Chúng tôi có quy trình vận hành tiêu chuẩn (SOPs - Standard operating procedures) đối với mỗi bước duy nhất và đối với các loại mẫu khác nhau mà chúng tôi phân tích. Chúng tôi thường xuyên kiểm tra thiết bị và các bề mặt mà chúng tôi làm việc để đảm bảo không có ô nhiễm. Đó là cách duy nhất để chúng tôi có thể đảm bảo về dữ liệu của chúng tôi.

Câu hỏi: Đối với PCR thì vấn đề đào tạo quan trọng như thế nào?

Hodzic: Vấn đề đào tạo là rất quan trọng và các nhân viên của chúng tôi phải trải qua một vài tháng đào tạo. Có rất nhiều hội thảo và các khóa học về phương pháp định lượng PCR (qPCR) được tổ chức trong khuôn viên trường. Việc thiết lập real-time qPCR rất dễ dàng, nhưng từng bước và mọi bước đi cùng lại vô cùng quan trọng.

Khi chúng tôi gặp gỡ với khách hàng của mình, chúng tôi luôn dành thời gian thảo luận làm thế nào để thiết kế các thí nghiệm PCR, những loại mẫu nào cần được sử dụng và làm thế nào để thu thập cũng như lưu trữ chúng. Việc xử lý mẫu, việc khai thác oligonucleotide, kiểm soát chất lượng - mọi thứ cần được đánh giá một cách cẩn thận.

Tất cả nhân viên của chúng tôi đều được đào tạo trong việc thực hiện các bước PCR và làm thế nào để khắc phục sự cố nếu có vấn đề xảy ra. Tuy nhiên, việc trao đổi thông tin và thảo luận với các đồng nghiệp luôn rất hữu ích dù cho có thông thạo đến đâu.

Câu hỏi: Có phải đã có rất nhiều thay đổi trong PCR những năm gần đây? Ông đã cân nhắc đến việc sử dụng PCR kỹ thuật số chưa?

Hodzic: Thiết bị kỹ thuật cho PCR không thay đổi nhiều trong thập kỷ qua. Cũng đã có những công nghệ mới như PCR kỹ thuật số đã được giới thiệu, nhưng chúng tôi chưa thấy PCR kỹ thuật số được sử dụng trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. PCR kỹ thuật số không có khả năng để phân tích các tác nhân gây bệnh phức tạp từ những mẫu tương tự hoặc để quan sát 30 đến 40 mẫu cùng một lúc.

Kỹ thuật này đòi hỏi lao động và phù hợp hơn cho mục đích nghiên cứu, không phải cho chẩn đoán. Mặc dù tôi không cho rằng PCR thời gian thực sẽ thay đổi nhiều trong vài năm tới, nhưng các hệ thống thăm dò đang được sử dụng sẽ phát triển, và PCR chắc chắn sẽ được sử dụng nhiều hơn cho các ứng dụng chẩn đoán.

Câu hỏi: Ông đã sử dụng PCR kỹ thuật số trong phòng thí nghiệm của mình bao lâu rồi?

Sedlak: Chúng tôi đã sử dụng thiết bị PCR kỹ thuật số dạng giọt từ một vài năm nay. Chúng tôi bắt đầu sử dụng thiết bị này trong phòng thí nghiệm lâm sàng để xem nó có lợi cho việc chăm sóc lâm sàng hay không và sau đó bắt đầu sử dụng cho việc nghiên cứu của chúng tôi, đặc biệt là đối với định lượng tải lượng virus và chỉnh sửa gen, quan sát các đột biến được giới thiệu bởi meganucleases hoặc các hệ thống CRISPR/Cas. Những gì chúng tôi thấy được là PCR kỹ thuật số hoạt động tốt hơn đối với các ứng dụng mà bạn cần đo lường chính xác.

Câu hỏi: Các ứng dụng nào bảo đảm việc sử dụng PCR kỹ thuật số?

Jerome: PCR kỹ thuật số đang tạo điều kiện cho chúng tôi trong việc phát triển cách chữa bệnh nhiễm trùng mãn tính do virus như HIV, viêm gan B, và herpes. Chúng tôi đang phát triển một số endonuclease xác định, trong đó có hệ thống protein CRISPR/Cas.

Những nucleases có thể giúp tìm ra DNA của virus trong tế bào và gây ra những đột biến cụ thể có thể gây chết các virus. Đây là một công nghệ cực kỳ mạnh mẽ và đầy hứa hẹn. Đối với công việc này, chúng tôi cần hai phép đo quan trọng. Đầu tiên, chúng tôi cần phải tìm ra chính xác có bao nhiêu virus tồn tại trong các mô hình thử nghiệm của chúng tôi, chúng tôi có thể gây ảnh hưởng đến loại virus này bao nhiêu, và sau đó có bao nhiêu virus bị phá hủy.

Chúng tôi cần một công nghệ rất chính xác để đo lường. qPCR thực sự có khả năng tốt nhất trong việc phát hiện sự khác biệt ở quy mô lớn và không thể phân biệt một vài thay đổi ở cấp độ phần trăm. Mặt khác, PCR kỹ thuật số cung cấp độ chính xác tinh tế để đánh giá tải lượng virus ở mức độ phần trăm.

Thứ hai, chúng tôi có thể sử dụng PCR kỹ thuật số để giám sát những đột biến cụ thể mà chúng tôi gây ra trong các virus để xác định chính xác các phần chúng tôi muốn tiêu diệt. Chúng tôi có thể thực hiện PCR trên các alen cụ thể hoặc trên alen đối xứng bằng cách sử dụng qPCR, nhưng với công nghệ kỹ thuật số, chúng tôi có thể tìm thấy một tỷ lệ rất nhỏ các đột biến trong nền tảng của các loại virus chưa xác định. Khi chúng tôi có được hiệu quả cao hơn, chúng tôi có thể có được con số rất chính xác về tỷ lệ phần trăm của virus đã được biến đổi. Ứng dụng cụ thể này thực sự mang đến sự chính xác lớn mà PCR kỹ thuật số cung cấp so với qPCR.

Theo www.labmanager.com