Thống nhất phương pháp xác định acid hữu cơ trong nguyên liệu TĂCN

Theo Công văn 1630/CN-TĂCN, Cục Chăn nuôi đã phối hợp với Công ty TNHH Đảm bảo Chất lượng Việt Nam (AoV) tổ chức tập huấn cho hơn 30 học viên đến từ 18 đơn vị. Cùng với tập huấn về lý thuyết, học viên đã được chia thành 8 nhóm để thực hành phương pháp phân tích các chỉ tiêu acid hữu cơ trong nguyên liệu TĂCN bằng sắc ký lỏng - Detector PhotoDiode Array hoặc UV.

Các acid hữu cơ thường dùng để bổ sung vào TĂCN hiện nay gồm acid Formic, Propionic, Butyric và Benzoic, trong đó, acid Formic được biết đến bởi khả năng sát khuẩn mạnh; acid Propionic: Ức chế nấm mốc phát triển trong thức ăn; acid Butyric: Sát khuẩn gram – và gram +, kích thích lợn ăn nhiều, bảo vệ thượng bì ruột, kích thích lớp tế bào lông nhung phát triển tốt, kích thích hệ miễn dịch của ruột (tăng hàm lượng α, β và γ globulin máu); acid Benzoic: Điều chỉnh độ acid, tăng mùi vị.

Vai trò của các acid hữu cơ

Đối với TĂCN:

- Ngăn chặn sự phát triển nấm mốc và mycotoxin.

- Làm giảm ảnh hưởng của các tác nhân gây bệnh có trong thức ăn.

Đối với động vật:

- Ức chế sự phát triển của vi khuẩn có hại, duy trì cân bằng vi khuẩn đường ruột.

- Tiêu diệt vi khuẩn bệnh.

- Hỗ trợ sự tiêu hoá và hấp thu các chất dinh dưỡng.

Đối với các khía cạnh xã hội: Ngăn chặn sự phát triển kháng kháng sinh bằng cách giảm sử dụng kháng sinh trang trại; Tăng giá trị dinh dưỡng của các thành phần chất lượng thấp.

Đối với các khía cạnh môi trường: Góp phần bổ sung khoáng chất thấp vào thức ăn, do đó làm giảm sự phú dưỡng trong môi trường, giảm phát thải amoniac.

Đối với các khía cạnh kinh tế: Tăng hiệu quả năng suất chăn nuôi, tăng giá trị dinh dưỡng của các thành phần chất lượng thấp.

Với các vai trò đó, acid hữu cơ thường được dùng hỗn hợp từ 2 đến 4 loại để bổ sung tác dụng cho nhau.

Cơ chế ức chế vi khuẩn bệnh của acid hữu cơ

Cơ chế ức chế vi khuẩn bệnh của acid hữu cơ được giải thích như sau: Trong đường ruột tồn tại các nhóm vi khuẩn có ích và vi khuẩn bệnh, số lượng các nhóm này được duy trì ở trạng thái cân bằng (eubiosis). Do những nguyên nhân nào đó, số lượng vi khuẩn bệnh tăng lên, trạng thái cân bằng bị phá vỡ (dysbiosis), con vật bị rối loạn tiêu hóa và mắc bệnh.

Nhóm vi khuẩn có ích thường là những vi khuẩn lên men sinh acid lactic như Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus…. Nhóm vi khuẩn bệnh thường là E.coli, Samonella, Clostridium perfringens, Staphilococcus aurius…

Trên các nền mẫu nguyên liệu TĂCN gồm hỗn hợp các acid hữu cơ và muối: Formic, Acetic, Lactic, Propionic, Butyric, Benzoic; các phụ gia khác: acid Phosphoric, Enzym, Canxi; các chất chiết xuất từ thực vật, hương liệu, chất mang, chất nền,… học viên đã được thực hành các phương pháp xác định acid hữu cơ bằng Sắc ký ion (IC), Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS, LC-MS/MS), Sắc ký khí (GC) và Sắc ký lỏng, detector UV (LC- UV).

Để xác định các acid hữu cơ trên thiết bị UPLC H-Class, các kiểm nghiệm viên đã sử dụng tốc độ dòng từ 0.010 - 2.000 mL/min; Max. Pressure: 15,000 psi (1 mL/min) hoặc 9000 psi (2 mL/min); Detector TUV (Tunable UV Detector): 2 channels; Cột Prevail Organic acid 5um, 150 mm; 4.6mm.

Pha động

* Pha động A: Methanol

* Pha động B: H₃PO₄ 0,05M

Quy trình phân tích xác định hàm lượng acid Benzoic

Quy trình phân tích xác định hàm lượng acid Benzoic được thực hiện như sau:

Cân 0,05g  mẫu đồng nhất hòa tan với hỗn hợp MeOH: H₃PO₄ 0,05M (90:10) trong bình định mức 25mL => Rung siêu âm 10-20min, để nguội, định mức bằng hỗn hợp MeOH:H₃PO₄ 0,05M (90:10) và lọc mẫu qua màng 0.22 µm => Hút 10-100uL dịch lọc chuyển vào vial 2mL, thêm lượng hỗn hợp MeOH:H₃PO₄ 0.05M (90:10) tương ứng để được 1mL => Phân tích trên hệ UPLC-TUV.

Kết quả khảo sát pha động

Từ các kết quả khảo sát trên cho thấy, điều kiện tối ưu để xác định hàm lượng acid Benzoic trên thiết bị UPLC-TUV với tốc độ dòng: v=0,6mL/min; Tỷ lệ pha động: 90 MeOH:10H₃PO₄ 0,05M; Thời gian lưu: 3,27 phút (±0.2); Bước sóng: 228nm.

Quy trình phân tích xác định hàm lượng acid Formic, Butyric và Propionic

Quy trình phân tích xác định hàm lượng acid Formic, Butyric và Propionic được thực hiện như sau: Cân 0,20g mẫu đồng nhất hòa tan với nước trong bình định mức 50mL => Rung siêu âm trong vòng 20min, để nguội, định mức bằng nước và lọc mẫu qua màng 0.22 µm => Phân tích trên hệ UPLC-TUV.

Kết quả khảo sát pha động

Điều kiện chạy UPLC-TUV tối ưu ở tốc độ dòng: v=0,6mL/min;

- Tỷ lệ pha động: 

0-4min: 100% H₃PO₄

4-5min: 15MeOH: 85 H₃PO₄ 0,05M;

5-17min: 38MeOH: 62 H₃PO₄ 0,05M;

18-20min: 100% H₃PO₄

- Bước sóng: 210nm

Khoảng tuyến tính của acid Formic, Propionic và Butyric: 50-2500 mg/kg; acid Benzoic: 5-100 mg/kg. Hiệu suất thu hồi: 98-102%; Độ không đảm bảo đo: <5%. Phương pháp này đã được áp dụng để phân phân tích mẫu nguyên liệu TĂCN và phù hợp để phân tích các acid hữu cơ acid Formic, Propionic, Butyric và Benzoic trong nguyên liệu TĂCN.

Nhận xét kết quả thực hành phân tích của 8 nhóm, ông Nguyễn Viết Hải, Giám đốc Giám định Công ty VinaCert lưu ý các học viên, nếu làm việc gì đó trên thực tế, kết quả đúng 99% đã là rất tốt nhưng đối với các đơn vị thử nghiệm, kiểm nghiệm, kết quả chỉ sai 1% đã là rất nghiêm trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến việc đánh giá hay kết luận về chất lượng của một sản phẩm. Phía sau kết quả phân tích của kiểm nghiệm viên là hơn 90 triệu dân Việt Nam, do đó mỗi thao tác phải hết sức cẩn thận và phương pháp áp dụng phải chuẩn xác.

Đồng quan điểm trên, ông Bùi Hữu Điển, Cố vấn thử nghiệm của VinaCert chia sẻ, các học viên đến từ 18 đơn vị có uy tín trong lĩnh vực phân tích, về cơ bản các thao tác đã rất chuẩn mực. Tuy nhiên, mỗi kiểm nghiệm viên có thể được đào tạo tại các trường khác nhau, cách đào tạo và thiết bị khác nhau nên thao tác có thể không đồng nhất, đây là một trong những nguyên nhân gây sai số của phép thử.

Thực hiện chủ trương của Cục Chăn nuôi trong việc thống nhất phương pháp xác định một số chỉ tiêu acid hữu cơ và để các phòng thử nghiệm TĂCN có ý nghĩa quan trọng trong công tác quản lý nhà nước về chất lượng TĂCN. Hội các Phòng thử nghiệm Việt Nam đang có ý tưởng chuẩn hóa lại các thao tác cơ bản trong phòng thử nghiệm, giúp các kiểm nghiệm viên nâng cao hơn nữa kỹ thuật và chuyên môn của mình, ông Bùi Hữu Điển chia sẻ.

VŨ HẢI