Những ranh giới mới trong kỹ thuật PCR: Tiến tới kỹ thuật số hoặc không? (Kỳ 2)

Hỏi: Những hạn chế của việc sử dụng kỹ thuật số PCR là gì?

Jerome: Những hạn chế khi sử dụng kỹ thuật số PCR là khá ít. Trong một số trường hợp, nó thường dễ bỏ qua các loại mẫu khác nhau hơn so với qPCR. Nó kháng lại ức chế mẫu. Một khi bạn đã thiết kế tốt một khảo nghiệm qPCR, thì sẽ chỉ cần thực hiện rất ít xác nhận bổ sung để chuyển đổi nó sang kỹ thuật số PCR. Do đó, rào cản khi thực hiện PCR kỹ thuật số ở một phòng thí nghiệm đã thực hiện qPCR cũng khá là thấp. Hạn chế chính trong một số các hệ thống PCR kỹ thuật số thế hệ đầu tiên là thông lượng tổng thấp hơn so với hệ thống qPCR cấp lâm sàng sử dụng đĩa 96 giếng. PCR kỹ thuật số cần sử dụng các thao tác tay lâu hơn, nhưng đối với các ứng dụng nghiên cứu thì đây không phải là vấn đề, bởi vì chúng tôi không cần làm hàng ngàn mẫu.

Sedlak: Thời gian cần thiết để thực hiện các thao tác bằng tay phụ thuộc vào cách phòng thí nghiệm qPCR của bạn được thiết lập. Phòng thí nghiệm lâm sàng của chúng tôi đã được thiết kế rất hiệu quả để thực hiện qPCR kể từ khi chúng tôi làm thử nghiệm lâm sàng với số lượng lớn. Do đó, đối với phòng thí nghiệm của chúng tôi, các công cụ PCR kỹ thuật số được thiết lập để thực hiện với đĩa 96 giếng cũng mất nhiều thời gian hơn qPCR khoảng ba lần. Nhược điểm của PCR kỹ thuật số là nó không phải là một phép đo thời gian thực như qPCR. Nó là một phép đo điểm cuối, và cần thêm một vài giờ để thí nghiệm tổng thể. Các thiết lập ban đầu của các phản ứng mất thời gian nhiều hơn khoảng 45 phút so với qPCR. Tuy nhiên, đã có sẵn thiết bị đo đạc robot, đây cũng là một lựa chọn cho máy tạo giọt nhằm làm giảm thời gian thiết lập, và phòng thí nghiệm nghiên cứu của chúng tôi cũng sử dụng nó khi tạo ra các tấm phản ứng. Tương tự như qPCR, các kết quả cho ra từ một công cụ kỹ thuật số cũng sẽ chỉ tốt bằng các xét nghiệm mà bạn đã phát triển. Tuy nhiên, trong PCR kỹ thuật số, nếu xét nghiệm của bạn không hoạt động đúng thì sẽ thể hiện ra rất rõ ràng, và đây là một điều tốt bởi vì sau đó bạn có thể tối ưu hóa các xét nghiệm hơn. Bạn cũng có thể thấy rõ các vấn đề có ảnh hưởng khi sử dụng PCR kỹ thuật số mà thường bị che giấu khi sử dụng qPCR.

Hỏi: Làm thế nào để so sánh về chi phí giữa PCR truyền thống và PCR kỹ thuật số?

Sedlak: Các chi phí tiêu dùng và các thuốc thử vào khoảng $3 đến $5 mỗi giếng cho một khảo nghiệm kỹ thuật số tùy thuộc vào thông lượng của bạn, không tốn hơn nhiều so với qPCR. Chi phí không phải là một cản trở, và các loại thông tin mà bạn nhận được là thứ bạn không thể có được khi sử dụng qPCR.

Jerome: PCR kỹ thuật số có những khía cạnh rõ ràng vượt trội hơn qPCR, nhưng đối với nhiều ứng dụng những lợi thế này lại không ăn thua. Chẳng hạn như tải lượng virus lâm sàng thường xuyên của chúng tôi vẫn được đo lường bằng cách sử qPCR, cách này cung cấp thông lượng cao và đơn giản. Những con số mà bạn nhận được sẽ chính xác hơn so với PCR kỹ thuật số, nhưng trong những nghiên cứu vừa và nhỏ, chúng tôi không thể chứng minh ưu thế về việc chăm sóc bệnh nhân hay quản lý. Vì vậy, người ta cần phải cẩn thận lựa chọn các ứng dụng mà những ưu điểm của PCR kỹ thuật số có thể thể hiện tốt hơn trong nghiên cứu hoặc chăm sóc bệnh nhân.

Hỏi: Ông/bà chọn hệ thống PCR kỹ thuật số để sử dụng như thế nào?

Sedlak: Đối với chúng tôi, các dụng cụ kỹ thuật số giọt cung cấp thông lượng tốt hơn và ít tiêu hao chi phí hơn khi so sánh với các công cụ dựa trên chip. Các hệ thống dựa trên chip có ít phân vùng hơn nhưng tiêu hao tốn kém hơn cho mỗi phân vùng. Tuy nhiên, các hệ thống dựa trên chip đôi khi có thể thực hiện thí nghiệm PCR thời gian thực và có thể cho ra kết quả kỹ thuật số ở cuối. Chúng tôi không có nhu cầu cho kết quả thời gian thực trong các thí nghiệm PCR kỹ thuật số của chúng tôi, nhưng nếu đó là điều bạn cần, thì sử dụng một định dạng dựa trên chip cung cấp các tùy chọn sẽ tốt hơn.

Jerome: Các lựa chọn khác được cung cấp bởi phương pháp tiếp cận truyền thông dựa trên chip hoặc chất rắn rất hấp dẫn trong lĩnh vực nghiên cứu, vì người ta có thể lấy lại các giếng tích cực trong phản ứng và trình tự các axit nucleic trong mỗi giếng sau đó. Hệ thống giọt không cho phép chúng tôi nắm bắt những giọt tích cực và trình tự riêng rẽ của chúng.

Hỏi: Những khiếm khuyết nào trong PCR kỹ thuật số mà ông/bà muốn cải thiện?

Sedlak: Cải tiến về mặt thông lượng và về thời gian thực hiện các thao tác tay cũng như giảm thiểu các biến cố xảy ra bởi các bước thực thiện bằng tay khác nhau chắc chắn là các lĩnh vực có thể được cải thiện trong PCR kỹ thuật số.

Jerome: Tôi hy vọng rằng các nhà sản xuất sẽ tăng số lượng kênh có thể phân tích được bằng PCR kỹ thuật số giọt. Ruth đã dành rất nhiều thời gian phát triển các phương pháp ghép thông minh sử dụng việc gắn nhãn khác biệt, nhưng hiện tại chúng tôi chỉ có hai màu sắc có sẵn. Do đó, ghép kênh bậc cao cho chất phân tích là rất khó khăn khi sử dụng PCR kỹ thuật số vào lúc này. Đối với thử nghiệm ghép cho nhiều virus, việc sử dụng nhiều kênh và màu sắc khác nhau sẽ rất hữu ích.

Hỏi: Ông/bà có lời khuyên nào dành cho những người đang có ý định đầu tư vào PCR kỹ thuật số không?

Jerome: Tôi sẽ khuyên mọi người phải cân nhắc thật kỹ về các ứng dụng của họ và xem những ưu điểm của PCR kỹ thuật số có giá trị cho ứng dụng đó hay không. Nếu độ chính xác là quan trọng nhất thì PCR kỹ thuật số là lựa chọn tuyệt vời. Nếu bạn cần tìm và định lượng dữ kiện hiếm trong nền tảng của các dữ kiện tự nhiên thì kỹ thuật số cũng là lựa chọn rất tốt. Tuy nhiên, nếu bạn chỉ muốn đo lường có bao nhiêu chất phân tích đang hiển thị thì qPCR sẽ dễ dàng hơn trong sử dụng và cung cấp thông lượng. Kỹ thuật số sẽ làm tăng thêm phức tạp, và người ta cần phải suy nghĩ kỹ càng về việc nó có thực sự cần thiết hay không.

Emir Hodzic, Tiến sĩ, Bác sĩ Thú y tốt nghiệp ngành thú y tại Đại học Sarajevo, Bosnia và Herzegovina, ông đã có bằng thạc sĩ và tiến sĩ. Sau khi hoàn thành nghiên cứu sinh sau tiến sĩ tại Đại học Yale, ông chuyển đến Trung tâm Y học so sánh tại Đại học California, Davis. Từ năm 2005, ông đảm nhiệm vị trí Giám đốc của Sở Nghiên cứu PCR thời gian thực và Chẩn đoán lõi.

Tiến sĩ Keith R. Jerome là người đứng đầu Bộ phận Virus học tại Khoa Y học Thực nghiệm, Đại học Washington và là thành viên của chương trình kết hợp về khoa học bệnh truyền nhiễm /virus học tại Trung tâm Nghiên cứu Ung thư Fred Hutchinson. Ông đã nhận được bằng Bác sĩ Y khoa và Tiến sĩ của Đại học Duke. Ông đã hoàn thành đào tạo sau đại học về Y học trong phòng thí nghiệm và virus học tại Đại học Washington.

Tiến sĩ Ruth Hall Sedlak là một nhà khoa học về nghiên cứu virus học phân tử trong phòng thí nghiệm tại Khoa Y học Thực nghiệm của Đại học Washington. Bà đã giành được bằng Tiến sĩ về vi sinh và công nghệ nano tại Đại học Washington vào năm 2011. Sau khi hoàn thành đào tạo sau tiến sĩ với Tiến sĩ Keith Jerome về chẩn đoán virus herpes và các ứng dụng của PCR kỹ thuật số, bà tiếp tục làm việc trong phòng thí nghiệm với cương vị là một nhà khoa học phát triển chẩn đoán.

Theo www.labmanager.com