Tinh Giản Việc Sử Dụng Dữ Liệu Khối Phổ Có Độ Phân Giải Cao Để Tìm Kiếm Mật Ong Pha Trộn

Lúc đầu, việc tiếp cận các sản phẩm nghi ngờ với khối phổ độ phân giải cao có thể có vẻ đáng sợ do sự phức tạp cao của dữ liệu, vì tìm thấy bằng chứng trong hàng ngàn chất là việc bình thường. Sự tiến bộ trong nhiều năm qua đã tập trung vào việc giải quyết lượng dữ liệu khối phổ lớn này cùng với phân tích thống kê để nhanh chóng cho ra kết quả có thể giải thích dễ dàng. Với gói phần mềm Progenesis QI, Waters đã tìm cách cung cấp một quy trình công việc dễ dàng sử dụng, có hướng dẫn trực quan cho phân tích thống kê của dữ liệu khối phổ.

Trong Progenesis QI, các bước quy trình công việc có một thứ tự hợp lý và bao gồm tất cả mọi thứ từ nhập dữ liệu, phát hiện các điểm nổi bật, bình thường hóa mẫu, phân tích thống kê đa biến để xác định các thành phần liên quan có thể phân biệt các nhóm mẫu.

Phần mềm Progenesis đã được sử dụng thành công cho phân tích thống kê các chất chuyển hóa, do nghiên cứu chất chuyển hóa đã đi tiên phong trong việc so sánh các nhóm để tìm kiếm các khác biệt quan trọng. Trong nghiên cứu này, mục đích là để chứng minh sự tiện ích của việc sử dụng dữ liệu khối phổ có độ phân giải cao lấy từ mật ong và hai sản phẩm có thể bị pha trộn để cho thấy rằng tìm kiếm dấu vết hàng loạt gồm hàng trăm hợp chất có thể nhanh chóng phân biệt thực phẩm và sự kết hợp của các loại thực phẩm này.

Các Phương Pháp Thu Thập Số Liệu

Để tạo thuận lợi cho việc so sánh các mẫu, phải cẩn thận lựa chọn và duy trì phương pháp trong khi thu thập dữ liệu từ tất cả các mẫu. Bộ dữ liệu cho phân tích thống kê bao gồm thông tin EMRT (Exact Mass Retention Time) cho tất cả các thành phần được phát hiện trong mẫu. Những điểm cần cân nhắc là phương pháp sắc ký và phối khổ thích hợp. Dữ liệu được thu lại bằng cách sử dụng Waters Acquity UPLC (mô hình cổ điển) và khối phổ kế Waters Xevo G2 QT (Melbourne, Australia).

Phương pháp được thực hiện sử dụng cả chế độ ion âm và dương, với các cột LC, gradient và bộ đệm được chọn để sàng lọc thích hợp với các chế độ ion quy định. Đối với chế độ ion dương, chọn thu thập dữ liệu giai đoạn đảo ngược sắc ký bằng cách sử dụng một hạt Waters UPLC BEH C18 1.7 µm, cột 2.1 mm x 100 mm. Pha động A là nước chứa 0.1% (v/v) axit formic, pha động B là acetonitrile chứa 0.1% (v/v) axit formic. Pha động B được giữ ở 2% (v/v) trong vòng 15 giây, sau đó là gradient đến 99% (v/v) B trong vòng 12 phút. Tốc độ dòng chảy được duy trì ở mức 0.450 mL/phút và cột nhiệt độ đặt mức 45°C.

Đối với chế độ ion âm, việc thu thập dữ liệu sắc ký HILIC được thực hiện bằng cách sử dụng hạt Waters BEH Amide 1.7 µm, cột 2.1 mm x 100 mm, do chế độ sắc ký và ion này bổ sung cho các loại đường đơn giản và một vài chất chuyển hóa phân cực. Pha động A là 100% acetonitrile, pha động B là nước chứa 10 mM ammonium formate pH 8. Pha động B được giữ ở mức 2% trong 15 giây, sau đó là gradient đến 90% B trong vòng 12 phút. Tốc độ dòng phải được duy trì ở mức 0.450 mL/phút và cột nhiệt độ đặt ở mức 60°C. Tổng thời gian thu thập là 15 phút.

Phương pháp phối khổ cho cả hai chế độ ion là MSE – một phương pháp đơn giản, được cấp bằng sáng chế, dành cho việc thu thập dữ liệu khách quan mà ghi lại một cách toàn diện các mẫu phức tạp trong một lần phân tích đơn lẻ. Phạm vi khối của 50 đến 1200 m/z được quét, với các đợt quét năng lượng va chạm thấp và cao 0.3 giây xen kẽ. Đối với đợt quét năng lượng cao (kênh năng lượng phân mảng cao) năng lượng va chạm được đẩy mạnh từ 10 đến 45 eV. Leucine-enkephalin được dùng làm lockspray, thu trong 0.5 giây ở chu kỳ 20 giây. Quang phổ khối của lockspray được ghi lại một kênh riêng biệt mà được sử dụng để hiệu chỉnh lại dữ liệu thu được, giúp cải thiện độ chính xác của khối đến mức khoảng 5 ppm.

Các mẫu được dùng là mật ong (chọn một nhãn hiệu nội địa lớn của Úc), mẫu si-rô vàng (nguyên liệu chính là si-rô đường mía), và một nhãn hiệu si-rô vị gỗ thích (nguyên liệu chính là si-rô glucose lúa mạch). Do không có sẵn các sản phẩm si-rô bắp nên trong các mẫu không có loại này, nhưng việc lấy mẫu si-rô này là hợp lý đối với một vài thị trường mà sản phẩm này có khả năng là sản phẩm pha trộn. Các mẫu bổ sung phân tích là hỗn hợp 1:1 của mật ong và si-rô đường mía, và hỗn hợp mật ong và si-rô glucose lúa mạch.

Chuẩn bị một hỗn hợp QC mà mỗi phần của mỗi sản phẩm bằng nhau. Mỗi sản phẩm được pha loãng 20 lần với nước, trộn đều cho đến khi đồng nhất và đưa qua một bộ lọc microcentrifuge 0.2 micron. Kiểm soát âm tính của dung môi chiết xuất là dung dịch nước pha loãng như trên qua một bộ lọc giống hệt. Dùng lượng tiêm 5 µL cho mỗi mẫu.

Xử lý Dữ liệu với Progenesis QI

Dữ liệu mẫu được nhập trực tiếp trong phần mềm Progenesis QI. Progenesis QI tương thích với rất nhiều các công cụ, không chỉ riêng các công cụ cung cấp bởi Waters. Đối với phân tích protein của bộ mẫu, có một gói phần mềm riêng biệt khác ở một vài điểm (về định lượng và nhận biết), nhưng có quy trình công việc song song. Một khi dữ liệu được nhập, Progenesis QI sử dụng một quy trình công việc đồng phát hiện bắt đầu với khớp đỉnh sắc ký, tiếp đó là chọn đỉnh và chuẩn hóa. Quá trình này loại bỏ các giá trị bị mất và cho phép việc áp dụng thống kê đơn biến và đa biến hiệu quả hơn. Kết quả “phân tích thành phần chính” (PCA) không có giám sát, nghĩa là nó không biết mẫu nào ở trong cùng 1 nhóm. Các mẫu nào giống nhau nhất sẽ được đặt thành cụm cạnh nhau, và sẽ tách biệt khỏi các mẫu rất khác biệt.

Waters có cung cấp gói phần mềm Ezinfo (Umetrics, Thụy Điển) cho việc phân tích thêm, ví dụ như biểu đồ S-plot. S-plot là một trong những công cụ có thể hỗ trợ đồ họa trực quan cho những thành phần phát hiện được trong mẫu mà làm cho nhóm mẫu khác biệt với những nhóm khác. Ta có thể chọn các thành phần trong S-plot, sau đó xem thông tin sắc ký và hồ sơ độ phong phú trong Progenesis QI.

Các mẫu trong chế độ ion âm không trả kết quả từ tìm kiếm trong cơ sở dữ liệu, tuy nhiên một vài xác định dự đoán được trả về từ dữ liệu chế độ ion dương. Việc đơn giản hóa một tập hợp dữ liệu phức tạp rất lớn (từ hàng trăm đến có thể hàng ngàn các thành phần) để cô lập các thành phần quan tâm lớn nhất được minh họa rõ hơn trong hồ sơ độ phong phú. Những hồ sơ độ phong phú này thể hiện các thành phần độc đáo hoặc thành phần nồng độ rất cao trong mật ong. Việc nỗ lực chọn ra danh sách các hợp chất với đặc trưng phong phú cho các mẫu cụ thể như thế bằng quy trình thủ công rất mất công và ít có khả năng thành công hơn.

Kết luận

Các mẫu mật ong pha trộn với các thức ăn khác có thể dễ dàng phân biệt bằng cách sử dụng phối khổ có độ phân giải cao. Các dấu hiệu tiềm năng phổ biến với mật ong hoặc được tìm thấy ở mức độ cao hơn trong các chất giả mạo đã được xác định và có thể sử dụng để phát triển các phân tích chủ đích thông qua các công cụ khác, ví dụ như Multiple Reaction Monitoring (MRM) trong phối khổ bốn. Phân tích chủ đích có thể mang rủi ro làm giả do có thể có độ tinh khiết bắt chước nếu bản chất của xét nghiệm trở thành kiến thức phổ biến, và phân tích MRM không phát hiện được những thành phần chưa được mô tả mà có thể là một chất làm giả mới trước đây chưa từng thấy. Ngoài ra, các sản phẩm tự nhiên như mật ong có thể thay đổi từ năm này sang năm khác hoặc từ mùa này qua mùa khác, những dữ liệu thu thập được qua thời gian thực chất có thể xây dựng một thư viện về những biến đổi tự nhiên còn lớn hơn. Progenesis QI có thể được sử dụng để xây dựng một bộ dữ liệu để mô tả tất cả các hằng số và biến điển hình của một sản phẩm thực phẩm (đặc biết với sự hợp tác của các nhà sản xuất sơ cấp). Đối với dữ liệu phổ khối phân giải cao sắc ký lỏng, có 2 chương trình là Progenesis QI và Progenesis QI cho phân tích Protein. Progenesis QI được dùng cho nghiên cứu này, và áp dụng được cho tất cả các phân tử nhỏ (đường, vitamin, thuốc trừ sau, chất béo, v.v). Quy trình làm việc song song cho phân tích protein tương tự, nhưng tìm kiếm cơ sở dữ liệu protein là một quy trình hoàn toàn khác. Cả 2 ứng dụng đều được mô tả chi tiết ở tại địa chỉ www.nonlinear.com.

Theo Chromatography Today